训练1 化妆品中粪大肠菌群的测定1. 粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染,有可能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。
1.方法提要
根据粪大肠菌群所具有的生物特性,如革兰氏阴性无芽胞杆菌在44℃培养24~48h能发酵乳糖产酸并产气,能在选择性培养基上产生典型菌群,能分解色氨酸产生靛基质等特征,以兹鉴别。
2.培养基和试剂
(1)乳糖胆盐培养基
1)成分
蛋白胨 20g
猪胆盐 5g
乳糖 5g
质量分数为0.4%的溴甲酚紫水溶液 2.5mL
蒸馏水 1000mL
2)制法:将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中,调pH到7.4,加入指示剂,混匀,分装试管(每支试管中加一个小倒管)。115℃(101b)20min灭菌。
(2)双倍浓度乳糖胆盐培养耩 按上述乳糖胆盐培养基成分,蒸馏水量不变,其他成分量加倍。
(3)伊红美蓝(EMB)琼脂
1)成分
蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 5g
琼脂 20g
质量分数为2%的伊红水溶液 20mL
质量分数为0.5%的美蓝水溶液 13mL
蒸馏水 1000mL
2)制法:先将琼脂加到900mL蒸馏水中,加热溶解,然后加入磷酸氢二钾蛋白胨,混匀,使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.2~7.4,分装于烧瓶内,121℃(151b)15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂。冷至60℃左右以无菌手续加入灭菌的伊红美蓝溶液,摇匀。倾注平皿中备用。
(4)蛋白胨水(作靛基质试验用)
1)成分
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mL
2)制法:将上述成分加热溶化,调pH值为7.0~7.2,分装小试管,高压灭菌121℃(151b)15min。
(5)靛基质试剂
1)柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。
2)试验方法:接种细菌于蛋白胨水中,于44℃培养24h。沿管壁加柯凡克试剂0.3~0.5mL,轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
(6)革兰氏染色法
1)染色制备
①结晶紫染色液:将1g结晶紫溶于20mL乙醇(φ=95%)中,然后与80mL的1%草酸铵溶液混合。
②革兰氏碘液:将1g碘与2g碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
③脱色液:乙醇(φ=95%)。
④复染液
a.沙黄复染液:将0.25g沙黄溶解于10mL的乙醇(φ=95%)中,然后用蒸馏水稀释至100mL。
b.稀石碳酸复红液:称取碱性复红10g研细,加乙醇(φ=95%)100mL,放置过夜,滤纸过滤。取该液10mL,加质量分数为5%的石碳酸水溶液90mL混合,即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL,即为稀石碳酸复红液。
2)染色法
①将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
②滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
③滴加乙醇(φ=95%)脱色,约30s,或将酒精滴满整个涂片,立即倾去,再用酒精滴满整个涂片,脱色10s,水洗。
④滴加复染液,复染1min,水洗,待干,镜检。
3)染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
注意:如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染液,复染时间仅需10s。
3.仪器
1)恒温水浴或隔水式恒温箱:44℃。
2)温度计。
3)显微镜。
4)载玻片。
5)接种环。
6)电炉。
7)pH计或pH试纸。
8)高压消毒锅。
9)灭温吸管。
10)灭菌平皿。
操作步骤
1)取10mL 1:10稀释的样品,加到10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中,置44℃培养箱中培养24~48h,如不产酸也不产气,则报告为粪大肠菌群阴性。
如产酸产气,则划线接种到伊红美蓝琼脂平板上,置37℃培养18~24h。同时该取培养液1~2滴接种到蛋白胨水中,置44℃培养24h。
经培养后,在上述平板上观察有无典型菌群生长。大肠菌群在伊美红蓝琼脂培养基上的典型菌群呈深紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常具有金属光泽。也有的呈紫黑色,不带或略带金属光泽,或粉紫色,中心较深的菌群。亦常为大肠菌群,均应注意挑选。
2)挑取上述可疑菌群,涂片作革兰氏染色镜检。
3)在蛋白胨水培养液中,加入靛基质试剂约0.5mL,观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色;阴性反应液面呈试剂本色。
检验结果报告
平板上有典型菌群,并经证实为革兰氏阴性短杆菌,靛基质试验阳性,则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
训练2 化妆品中金黄色葡萄球菌的测定1. 金黄色葡萄球菌在外界分布较广,抵抗力也较强,能引起人体局部化脓性病灶,严重时可导致败血症,因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。
1.方法提要
根据本菌恃有的形态及培养特性,应用Baird Parker平板进行分离,该平板中的氯化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长,丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长,以提高检出率,并利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征,以兹鉴别。
2.培养基和试剂
(1)培养基SCDLP液体培养基。
(2)质量分数为7.5%的氯化钠肉汤
1)成分
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 75g
蒸馏水 1000mL
2)制法:将上述成分加热溶解,调pH为7.4,分装,121℃(151b)15min 高压灭菌。
(3)Baird Parker平板
1)成分
胰蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
酵母浸膏 1g
丙酮酸钠 10g
甘氮酸 12g
氯化锂(LiCl·6H
2O) 5g
琼脂 20g
蒸馏水 950mL(pH7.0±0.2)
2)增菌剂的配制:质量分数为30%的卵黄盐水50mL与除菌过滤的质量分数为1%的亚碲酸钾溶液10mL混合,保存于冰箱内。
3)制法:将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸完全溶解,冷至25℃校正pH。分装每瓶95mL,121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂,每95mL中加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL,摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。
(4)血琼脂培养基
1)成分
营养琼脂 100mL
脱纤维羊血(或兔血) 10mL
2)制法:将营养琼脂加热溶化,待冷至50℃左右以无菌手续加入脱纤维羊血,摇匀,制成平板,置冰箱内备用。
(5)甘露醇发酵培养基
1)成分
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
甘露醇 10g
牛肉膏 5g
质量分数为0.2%的溴麝香草酚蓝溶液 12mL
蒸馏水 1000mL
2)制法:将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中,加热溶解,调pH7.4,加入甘露醇和指示剂,混匀后分装试管中,115℃(101b)20min灭菌备用。
(6)兔(人)血浆制备取质量分数为3.8%的柠檬酸钠溶液[121℃(151b)30min灭菌]1份,加兔(人)全血4份,混匀静置,在2000~3000r/min离心3~5min。血球下沉,取上面血浆。
3.设备和材料
1)显微镜。
2)培养箱。
3)离心机。
4)灭菌吸管:1mL、5mL、10mL。
5)灭茵试管。
操作步骤
(1)增菌取1:10稀释的样品10mL接种到90mL SCDLP液体培养基中,置37℃培养箱,培养24h。
注:如无此培养基也可用质量分数为7.5%氯化钠肉汤,检验含防腐剂的化妆品时,可在1000mL此培养基中加1g卵磷脂、7g吐温80。
(2)分离 自上述增菌培养液中,取1~2接种环,划线接种在Baird Parker氏培养基,如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板,置37℃培养24~48h。在血琼脂平板上菌群呈金黄色,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,周围有溶血圈。在Baird Parker氏培养基上为圆形,光滑,凸起,湿润,直径为2~3mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明带。用接种针接触菌群似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌群,但无混浊带及透明带。挑取单个菌群分纯在血琼脂平板上,置37℃培养24h。
(3)染色镜检挑选分纯菌群,涂片,进行革兰氏染色,镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌,排列成葡萄状,无芽胞,无夹膜,致病性葡萄球菌,菌体较小,直径约为0.5~1μm。
(4)甘露醇发酵试验取上述分纯菌群接种到甘露醇发酵培养基中,置37℃培养24h,金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。
(5)血浆凝固酶试验
1)玻片法:取清洁干燥载玻片,一端滴加一滴灭菌生理盐水,另一端滴加一滴血浆,用接种环挑取待检菌群,分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌苔混悬液在5min内出现团块或颗粒状凝块时,而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象者为阳性,如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应或盐水滴与血浆滴均有凝固现象,再进行试管凝固酶试验。
2)试管法:吸取1:4新鲜血浆0.5mL,放入灭菌小试管中,再加入待检菌24h肉汤培养物0.5mL。混匀,放37℃温箱或水浴中,每半小时观察一次,24h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL,分别加入灭菌小试管内0.5mL 1:4血浆混匀,做为对照。
检验结果报告
凡在上述选择平板上有可疑菌落生长,经染色镜检,证明为革兰氏阳性葡萄球菌,并能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶试验阳性者,可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。
训练3 化妆品中绿脓杆菌的测定1. 绿脓杆菌在自然界分布甚广,空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力,常引起人皮肤化脓感染,特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后,常使病情恶化,并可引起败血症,因此,在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌。
1.方法提要
根据本菌生物学特征:革兰氏阴性杆菌,氧化酶阳性,能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶,还原硝酸盐为亚硝酸盐,在42℃条件下生长等,可与类似菌相区别。
2.培养基和试剂
(1)SCDLP液体培养基 见GB/T7918.1-1987《化妆品微生物标准检验方法总则》。
(2)十六万三甲基溴化铵培养基
1)成分
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
十六烷三甲基溴化铵 0.3g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
2)制法:除琼脂外,将上述成分混合加热溶解,调pH为7.4~7.6。加入琼脂,115℃(101b)20min灭菌后,制成平板备用。
(3)乙酰胺培养基
1)成分
乙酰胺 10.0g
氯化钠 5.0g
无水磷酸氢二钾 1.39g
无水磷酸二氢钾 0.73g
硫酸镁(MgSO
4·7H
2O) 0.5g
酚红 0.012g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
2)制法:除琼脂和酚红外,将其他成分加到蒸馏水中,加热分解,调pH为7.2,加入琼脂、酚红,121℃(151b)20min高压灭菌后,制成平板备用。
(4)绿脓菌色素测定用培养基
1)成分
蛋白胨 20g
氯化镁 1.4g
硫酸钾 10g
琼脂 18g
甘油(化学纯) 10g
蒸馏水 1000mL
2)制法:将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中,加温使溶解,调pH至7.4,加入琼脂和甘油,加热溶解,分装于试管内,115℃(101b)20min高压灭菌后,制成斜面备用。
(5)明胶培养基
1)成分
牛肉膏 3g
蛋白胨 5g
明胶 120g
蒸馏水 1000mL
2)制法:取各成分加在蒸馏水中浸泡20min,随时搅拌加温使溶解,调pH至7.4,分装于试管内,115℃(101b)20min灭菌后,直立制成高层备用。
(6)硝酸盐蛋白胨水培养基
1)成分
蛋白胨 10g
酵母浸膏 3g
硝酸钾 2g
亚硝酸钠 0.5g
蒸馏水 1000mL
2)制法:将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中,加温使溶解,调pH为7.2,煮沸过滤后补足液量。加入硝酸钾和亚硝酸钠,溶解混匀,分装到加有小倒管的试管中,115℃(101b)20min灭菌后备用。
(7)普通琼脂斜面培养基
1)成分
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 5g
琼脂 15g
蒸馏水 1000mL
2)制法:除琼脂外,将其余成分溶解于蒸馏水中,调pH为7.2~7.4,加入琼脂,加热溶解,分装试管,121℃(151b)15min高压灭菌后,制成斜面备用。
3.仪器
1)培养箱:37℃、42℃。
2)灭温平皿。
3)灭温刻度吸管。
4)显微镜。
5)接种针、接种环。
6)高压消毒锅。
操作步骤
(1)增菌培养取1:10样品稀释液10mL加到90mL的SCDLP液体培养基中,置37℃培养18~24h。如有绿脓杆菌生长,培养液表面多有一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
注意:如无SCDLP液体培养基时,可用普通肉汤培养基。检验含防腐剂的化妆品时,在每1000mL普通肉汤中加1g卵磷脂、7g吐温80。
(2)分离培养从培养液的薄菌膜处挑取培养物,划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上,置37℃培养18~24h。凡绿脓杆菌在此培养基上,其菌群扁平无定型,向周边扩散或略有蔓延,表面湿润,菌群呈灰白色,菌群周围培养基常扩散有水溶性色素,此培养基选择性强,大肠艾希氏菌不能生长,革兰氏阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离,将菌液划线接种于平肌中,放37℃培养24h,绿脓杆菌在此培--养菌上生长良好,菌群扁平,边缘不整,菌群周围培养基略带粉红色,其他菌不生长。
(3)染色镜检挑取可疑的菌群,涂片,革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
(4)氧化酶试验取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌群涂在滤纸片上,然后在其上滴加一滴新配制的质量分数为J%的二甲基对苯二胺试液,在15~30s之内,出现粉红色或紫红色时,为氧化酶试验阳性,若培养物不变色,氧化酶试验阴性。
(5)绿脓菌素试验取可疑菌群2~3个,分别接种在绿脓菌素测定用培养基上,置37℃培养24h,加入氯仿3~5mL,充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内,待氯仿提取液呈蓝色时,用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右,振荡后,静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性,表示被检物中有绿脓菌素存在。
(6)硝酸盐还原产气试验挑取被检的纯培养物,接种在硝酸盐胨水培养基中,置37℃培养24h,观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者,即为阳性,表明该菌能还原硝酸盐,并将亚硝酸盐分解产生氮气。
(7)明胶液化试验取绿脓杆菌可疑菌群的纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置37℃培养24h,取出放冰箱10~30min,如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性,如凝固不溶者为阴性。
(8)42℃生长试验挑取纯培养物,接种在普通琼脂斜面培养基上,放在41~42℃培养箱中,培养24~48h,绿脓杆菌能生长,为阳性,而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
检验结果报告
被检样品经增菌分离培养后,经证实为革兰氏阴性杆菌,氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者,即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时,仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。